Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)
Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) je molekularna citogenetska tehnika koja koristi fluorescentne probe koje se vežu samo na one delove sekvenci nukleinske kiseline sa visokim stepenom komplementarnosti. U biologiji proba je jedan lanac DNK ili RNK koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci koja se testira. FISH su razvili biomedicinski istraživači ranih 1980-ih [10] za otkrivanje i lokalizaciju prisustva ili odsustva specifičnih DNK sekvenci na hromozomima.
Prvo se konstruiše proba. Proba mora biti dovoljno velika da se hibridizuje specifično sa svojim ciljem, ali ne toliko velika da sprečava proces hibridizacije. Proba je obeležena direktno fluoroforima za antitela ili biotinom. Označavanje se može obaviti na različite načine, kao što je nick translacija ili polimerazna lančana reakcija korišćenjem obeleženih nukleotida. Onda se priprema interfazni ili metafazni hromozom. Hromozomi su čvrsto vezani za podlogu, obično staklo. Ponovljeni nizovi DNK moraju se blokirati dodavanjem kratkih fragmenata DNK u uzorak. Proba se zatim primenjuje na DNK hromozoma i inkubira tokom otprilike 12 sati kada se odigrava proces hibridizacije. Nekoliko koraka pranja uklanja sve hibridizirane ili delimično hibridizirane probe. Rezultati se zatim vizuelizuju i kvantifikuju pomoću mikroskopa koji je sposoban da istakne boju i snima slike. [10]
Šema principa FISH eksperimenta za lokalizaciju gena u jezgru. [10]
Legenda: Nikova translacija [11] (ili glavna translacija), razvijena 1977. godine od strane Peter Rigbi-a i Paul Berga-a, je tehnika označavanja u molekularnoj biologiji u kojoj se DNK polimeraza I koristi za zamenu nekih nukleotida DNK sekvence sa njihovim obeleženim analozima, stvarajući obeleženi DNK niz koji se može koristiti kao proba u fluorescentnoj in situ hibridizaciji.
Resurs slike: Wikimedia
Molekularna hibridizacija između komplementarnih DNK sekvenci korišćena je za razvoj nove tehnologije koja omogućava vizuelizaciju biološkog materijala u skali koja leži između mikroskopske i molekularne, nepristupačne za mikroskopsku vizualizaciju. Svaka ćelijska ili subćelijska struktura vidljiva mikroskopom i koja sadrži molekul nukleinske kiseline (hromozom, nukleus ili ribozom) može se tretirati in situ nakon fiksacije na slajdu koji molekul nukleinske kiseline (RNK ili DNK) čini dostupnom za određeni fluorohrom -prenosna proba. Fiksacija fluorescencije pokazuje da je prisutna specifična sekvenca i omogućava njenu lokalizaciju. Odsustvo fluorescencije pokazuje da je sekvenca odsutna. FISH donosi važnu komplementarnu tehniku citogenetskoj ili genetskoj analizi jer daje informacije o hromozomskoj lokalizaciji sekvence, bilo da je izbrisana ili premeštena. [6]
Metafazna ćelija pozitivna na rearanžman bcr / abl, translokacija 9 - 22 (povezana sa hroničnom mijeloidnom leukemijom) pomoću FISH-a. Hromozomi se mogu videti u plavoj boji. Translokacija je označena hromozomima koji su obeleženi zelenim i crvenim mrljama (gore levo). [10]
Resurs slike: Wikimedia
Neke kariotipske anomalije, koje se ne mogu otkriti konvencionalnim metodama citogenetike (mikrodelekcije, uniparentalne dizomije itd.) mogu se otkriti ili identifikovati tehnikama kao što je fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) kombinujući kariotipizaciju i molekularnu biologiju. [6]
© www.humankaryotype.com